ПГУ, нь полимеразын гинжин урвал бөгөөд энэ нь ДНХ полимеразын катализын дор системд dNTP, Mg2+, суналтын хүчин зүйл, олшруулалтыг сайжруулах хүчин зүйлсийг нэмж, эх ДНХ-ийг загвар болгон ашиглаж, өргөтгөлийн эхлэлийн цэг болгон тусгай праймерыг ашигладаг. ДНХ-ийн эх хэлхээний загварт нэмэлт охин хэлхээ ДНХ-ийг in vitro хуулбарлах үйл явц нь денатураци, анивалт, өргөтгөл гэх мэт алхмуудыг хийснээр ямар ч зорилтот ДНХ-г in vitro-д хурдан бөгөөд тусгайлан өсгөж чаддаг.
1. Халуун эхлэх ПГУ
Уламжлалт ПГУ-д олшруулалтын эхлэх хугацаа нь ПГУ-ын машиныг ПГУ-ын машинд оруулахгүй байх бөгөөд дараа нь програм олшруулж эхэлдэг.Системийн тохиргоог хийж дуусмагц олшруулалт эхэлдэг бөгөөд энэ нь өвөрмөц бус олшруулалтыг үүсгэж болзошгүй бөгөөд халуун эхлүүлэх ПГУ нь энэ асуудлыг шийдэж чадна.
Халуун эхлэл ПГУ гэж юу вэ?Урвалын системийг бэлтгэсний дараа фермент хувиргагчийг урвалын эхний халаалт буюу "халуун эхлэх" үе шатанд өндөр температурт (ихэвчлэн 90 хэмээс дээш) ялгаруулж, ДНХ полимеразыг идэвхжүүлдэг.Яг идэвхжүүлэх хугацаа ба температур нь ДНХ полимеразын шинж чанар болон халуун эхлүүлэх хувиргагчаас хамаарна.Энэ арга нь голчлон ДНХ полимеразын үйл ажиллагааг дарангуйлахын тулд эсрэгбие, ойрын холбоо, химийн хувиргагч зэрэг хувиргагчдыг ашигладаг.Өрөөний температурт ДНХ полимеразын идэвхжил дарангуйлдаг тул халуун эхлүүлэх технологи нь ПГУ-ын урвалын өвөрмөц чанарыг алдагдуулахгүйгээр өрөөний температурт олон ПГУ-ын урвалын системийг бэлтгэхэд маш их тав тухтай байдлыг хангадаг.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transscription PCR) нь мРНХ-ээс cDNA руу урвуу транскрипц хийх туршилтын арга бөгөөд үүнийг олшруулах загвар болгон ашиглах явдал юм.Туршилтын арга нь эхлээд эд эс эсвэл эсээс нийт РНХ-г гаргаж авах, Олиго (dT)-ийг праймер болгон ашиглах, урвуу транскриптаза ашиглан cDNA-г нэгтгэх, дараа нь cDNA-г ПГУ-ын олшруулах загвар болгон ашиглан зорилтот генийг олж авах эсвэл генийн илэрхийлэлийг илрүүлэх явдал юм.
3. Флюресцент тоон ПГУ
Флюресцент тоон ПГУ (Бодит цагийн тоон ПГУ,RT-qPCR) нь ПГУ-ын урвалын системд флюресцент бүлгүүдийг нэмэх, флюресцент дохионы хуримтлалыг ашиглан ПГУ-ын процессыг бүхэлд нь бодит цаг хугацаанд хянах, эцэст нь стандарт муруйг ашиглан загварт тоон дүн шинжилгээ хийх аргыг хэлнэ.Түгээмэл хэрэглэгддэг qPCR аргуудад SYBR Green I болон TaqMan орно.
4. Nested PCR
Nested ПГУ гэдэг нь ПГУ-ын хоёр удаагийн олшруулалтад хоёр багц ПГУ праймерыг ашиглахыг хэлдэг бөгөөд хоёр дахь шатны олшруулалтын бүтээгдэхүүн нь зорилтот генийн фрагмент юм.
Хэрэв эхний хос праймерын (гадна праймер) тохирохгүй байгаа нь өвөрмөц бус бүтээгдэхүүнийг өсгөхөд хүргэдэг бол хоёр дахь хос праймераар ижил өвөрмөц бус бүсийг хүлээн зөвшөөрч, үргэлжлүүлэн өсгөх магадлал маш бага тул Хоёрдахь хос праймераар олшруулснаар ПГУ-ын өвөрмөц байдал сайжирсан.Хоёр удаагийн ПГУ-ын нэг давуу тал нь хязгаарлагдмал эхлэлийн ДНХ-ээс хангалттай хэмжээний бүтээгдэхүүнийг олшруулахад тусалдаг.
5. Touchdown PCR
Touchdown ПГУ нь ПГУ-ын мөчлөгийн параметрүүдийг тохируулах замаар ПГУ-ын урвалын өвөрмөц байдлыг сайжруулах арга юм.
Шуурхай ПГУ-ын хувьд эхний хэдэн мөчлөгийн температурыг праймерын хамгийн дээд температураас (Tm) хэдэн градусаар дээш тогтоодог.Илүү өндөр температур нь өвөрмөц бус олшруулалтыг үр дүнтэй бууруулж болох боловч үүнтэй зэрэгцэн илүү өндөр температур нь праймер болон зорилтот дарааллын салалтыг улам хүндрүүлж, ПГУ-ын гарцыг бууруулдаг.Тиймээс эхний хэдэн мөчлөгт систем дэх зорилтот генийн агуулгыг нэмэгдүүлэхийн тулд бүлээнжүүлэх температурыг ихэвчлэн цикл тутамд 1 ° C-аар бууруулдаг.Хагалах температурыг хамгийн оновчтой температурт буулгах үед үлдсэн мөчлөгийн туршид зөөлрүүлэх температурыг хадгална.
6. Шууд ПГУ
Шууд ПГУ гэдэг нь зорилтот ДНХ-ийг нуклейн хүчлийг тусгаарлах, цэвэршүүлэх шаардлагагүйгээр дээжээс шууд олшруулахыг хэлнэ.
Шууд ПГУ-ын хоёр төрөл байдаг:
шууд арга: бага хэмжээний дээж авч, ПГУ-ыг тодорхойлохын тулд ПГУ-ын мастер хольц руу шууд нэмнэ;
хагарах арга: дээжээс дээж авсны дараа лизат руу нэмж, геномыг ялгаруулахын тулд задралын дээд давхаргыг бага хэмжээгээр авч, ПГУ-ын Мастер Микс-д нэмж, ПГУ-ын тодорхойлолтыг хийнэ.Энэ арга нь туршилтын ажлын явцыг хөнгөвчлөх, дадлага хийх хугацааг багасгаж, цэвэршүүлэх үе шатанд ДНХ-ийн алдагдлаас сэргийлдэг.
7. SOE PCR
Давхардсан өргөтгөлөөр ген залгах ПГУ (SOE ПГУ) нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг давхардсан гинж үүсгэхийн тулд нэмэлт төгсгөлтэй праймеруудыг ашигладаг бөгөөд ингэснээр дараагийн олшруулах урвалд давхцсан гинжийг сунгах замаар олшруулсан фрагментуудыг давхцуулах А аргын янз бүрийн эх үүсвэрийг бий болгодог. ба хооронд нь холбосон.Энэ технологи нь одоогоор хоёр үндсэн хэрэглээний чиглэлтэй: нэгдэх генийг бүтээх;генийн сайт руу чиглэсэн мутаци.
8. IPCR
Урвуу ПГУ (IPCR) нь хоёр праймераас бусад ДНХ-ийн хэсгүүдийг олшруулахын тулд урвуу нэмэлт праймеруудыг ашигладаг бөгөөд мэдэгдэж буй ДНХ-ийн фрагментийн хоёр талд үл мэдэгдэх дарааллыг олшруулдаг.
IPCR нь зэргэлдээх үл мэдэгдэх бүсүүдийн дарааллыг тодорхойлоход зориулагдсан бөгөөд ихэвчлэн генийн промоторын дарааллыг судлахад ашиглагддаг;онкогений хромосомын өөрчлөлт, тухайлбал генийн нэгдэл, шилжүүлэн суулгах, шилжүүлэх;болон вирусын генийн интеграцчлалыг одоо бас түгээмэл ашиглаж байна.
9. dPCR
Дижитал ПГУ (dPCR) нь нуклейн хүчлийн молекулуудын үнэмлэхүй хэмжээг тодорхойлох арга юм.
Одоогийн байдлаар нуклейн хүчлийн молекулын хэмжээг тодорхойлох гурван арга байдаг.Фотометр нь нуклейн хүчлийн молекулуудын шингээлт дээр суурилдаг;бодит цагийн флюресцент тоон ПГУ (Бодит цагийн ПГУ) нь Ct утга дээр суурилдаг бөгөөд Ct утга нь илрүүлж болох флюресцентийн утгатай харгалзах мөчлөгийн дугаарыг хэлнэ;дижитал ПГУ бол нуклейн хүчлийг тоолох нэг молекул ПГУ-ын аргад суурилсан хамгийн сүүлийн үеийн тоон технологи юм.
Шуудангийн цаг: 2023 оны 6-р сарын 13